Dragi mikrobi

Budući da je vrijeme Pasteur Poznato je da ljudsko gastrointestinalnog trakta, je u suštini vrsta bioreaktor strujanja u kojem je više od mikroorganizama nastanjuju. Stav znanstvenika prema crijevnoj mikroflori tijekom tog razdoblja radikalno se promijenio. Prije sto godina, veliki Ilya Mechnikov, osnivač moderne teorije o imunitetu, za stvaranje što je dobio Nobelovu nagradu (za dvije osobe s njegovom neumoljivom protivnika, ne manje nego veliki Paul Ehrlich), čak predložio uklanjanje debelog crijeva kao način za produljenje života. A oni kojima je ta mjera činilo previše radikalan, preporuča se piti puno jogurta da bi se uklonio štetni, po njegovom mišljenju, mikroba blagotvoran laktobacili. Za pola stoljeća tečaj se promijenio za 180 stupnjeva. Ispostavilo se da je normalan crijevnu mikrofloru, te kožu i sluznicu, obaviti mnoge korisne funkcije - na primjer, potiskivanje vitalne funkcije tijela stalno napadaju patogene. I u posljednjih nekoliko godina, najsmjeliji mikrobiologa su otišli dalje izjavljujući osobu i njene simbiotskih mikroba jedan superorganizam.

Razvoj metoda molekularne biologije vodio je znanstvenike na novu razinu razumijevanja procesa simbioze čovjeka i njegove mikroflore, koji su se činili dobro proučavani i iz proučavanja kojih nisu očekivali posebna iznenađenja. Brz rast stope i troškova postupka sekvencioniranja DNA (određivanje njene nukleotidne sekvence) i paralelno povećanje snage osobnih računala i razvoj Interneta omogućilo je analizu podataka o velikim dijelovima genoma. Nakon što su kromosomi od stotina vrsta pojedinačnih bakterija bili dešifrirani, u genetici mikroorganizama nastao je novi pristup: pristup stanovništvu: analiza gena svih bakterija nastanjenih u određenom području. Naravno, populacija "humanog bioreaktora" pokazala se kao jedna od najvažnijih za proučavanje mikrobnih populacija.

Prvi rad, koji je napravio novi pogled na intestinalnu mikrobiotu, 1999. godine objavila je skupina znanstvenika Nacionalnog instituta za agronomske znanosti (Francuska) i Sveučilišta u Readingu (Velika Britanija). Autori su odlučili koristiti metodu sekvencioniranja 16S RNA gena za proučavanje mikrobne intestinalne populacije.

16S RNA - identifikacija bakterija

Od Pasteurova vremena, prva i potrebna faza u određivanju mikroorganizama bila je njihova kultivacija na hranjivim medijima. Ali mnogi važni (i korisni i patogeni) mikrobi ne žele rasti na bilo kojem od medija. Studija je prethodno nedostupna uncultivable bakterije i početi počistiti krajnje zbunjujuće taksonomiju poznatih prokariota postalo je moguće s razvojem bioinformatike i pojavom modernih tehnika molekularne biologije - lančana reakcija polimeraze (PCR), koji omogućuje samo jedan komad DNA dobiti milijune i milijarde točnih kopija, klon izolirani od PCR gena u bakterijskih plazmida i nukleotidnih metoda sekvenciranja, dobivena sve to dovoljno za ana Iza iznos.

Idealno marker za identifikaciju mikroorganizama pokazali gena koji kodiraju 16S ribosomna RNA (svaki od dva ribosomskih podjedinica - radionice sintezu staničnog proteina - sastoji se od usađenih lanaca molekula proteina i ribonukleinskih kiselina).

Ovaj gen je u genomu svih poznatih bakterija i arheje, ali nema u eukariota i virusa, a ako ste pronašli svoj karakterističan slijed nukleotida - Jeste li sigurni da se bave genima prokariota. (Da bi se vrlo precizno, gen 16S RNA tamo i kod eukariota, ali ne u nuklearnim kromosoma i mitohondrijske To još jednom potvrđuje da je mitohondriji -. Udaljeni potomci simbioze bakterija prvih eukariotskih organizama.)

Ovaj gen ima i konzervativna mjesta, jednaka za sve prokariote, i specifične za vrstu. Konzervativne parcele su prvi stadij lančane reakcije polimeraze - dodatak na ciljne DNA klica (sjemena DNA dijelovi na kojima proučavali Nukleotidni lanac treba pridružiti za početak analize ostatak sekvence) i za vrste specifičnih - za identifikaciju vrsta. Osim toga, stupanj sličnosti sekcija vrsta specifičnih odražava vrlo dobro evolucijski odnos različitih vrsta.

Dodatni bonus - za kloniranje i naknadnu analizu, možete koristiti samu ribosomalnu RNA, koja je u bilo kojoj stanici prisutna u mnogo većoj količini od odgovarajućeg gena. Samo mi najprije moramo "prepisati" DNK pomoću posebnog enzima - reverzne transkriptaze.

Općenito su dostupne nukleotidne sekvence 16S RNA svih poznatih bakterija i archaea (oko 10.000 vrsta). Identificirane sekvence uspoređuju se s onima koji se nalaze u bazama podataka i točno identificiraju vrste bakterija ili izjavljuju da pripadaju sljedećim neobrađenim vrstama.

Nedavno je provedena intenzivna revizija stare, fenotipske klasifikacije bakterija na temelju slabo formaliziranih kriterija - od pojave kolonija do preferencija hrane i sposobnosti da se boje s različitim bojama. Nova sustavnost temelji se na molekularnim kriterijima (16S RNA) i samo djelomično ponavlja fenotipski.

Kodirajuće sekvence 16S RNA PCR je dobiven direktno iz „okruženje” - 125 miligrama čovjeka, Nažalost, stolica, umetnut je u plazmid E. coli (ne zato što intestinalni, te zato Escherichia coli - jedan od molekularnim biolozima omiljeni radni stroj ) i opet izoliran iz kulture množenih bakterija. Tako je stvorena biblioteka 16S RNA gena za sve mikroorganizme u uzorku. Nakon toga, 284 klonova su slučajno odabrani i sekvencionirani. Ispalo je da samo 24% dobivenih 16S RNA sekvenci pripada prethodno poznatim mikroorganizmima. Tri četvrtine mikroflore nalazi u crijevima svakog čovjeka, više od stotinu godina izbjegavali pozornost istraživača, naoružani metodama klasične mikrobiologije! Znanstvenici jednostavno ne mogu naći uvjete za uzgoj tih bakterija, jer je većina ćudljiv stanovnici crijeva odbio ustati na tradicionalne mikrobnih okruženja.

Do danas, korištenjem molekularnih metoda, utvrđeno je da 10 od 70 velikih bakterijskih taksona je prisutno u odraslih mikrobiota. Oko 90% naših mikroorganizama pripada tipu firmicutes (to uključuje, na primjer, poznati laktobacila - glavni „krivci” souring mlijeko) i Bacteroidetes - obvezuje anaerobi (organizama koji mogu živjeti samo u nedostatku kisika), koje se često koriste kao pokazatelj onečišćenja prirodnu kanalizaciju vode. Preostalih 10% populacije podijeljena između svojti Proteobacteria (to su, između ostalih, E. coli), aktinobakterije (iz jedne od vrsta Actinomycetes antibiotika streptomicina se izolira), Fusobacteria (normalne stanovnika u usnoj šupljini, a često uzrokuju parodontitis), Verrucomicrobia (nedavno je u geotermalnog izvora otkriveno je oblik mikroba koji se hrane metanom, koji obiluju u crijevima zbog drugih mikroorganizama), Cyanobacteria (oni su još uvijek često nazivaju starim imenom „plavo-zelene alge»), Spirochaeates (za Wait TEW, ne blijeda), Synergistes i VadinBE97 (kakva životinja, pitajte kreatori novog taksonomiji prokariota).

Unatoč tome što je vrsta sastava crijevnih mikroorganizama prilično jednolična, kvantitativni omjer predstavnika određenih sustavnih skupina u mikrobioti različitih ljudi može se značajno razlikovati. Ali što je normalna crijevna mikroflora i koji su načini njezine formiranja?

Ovo je pitanje odgovoreno u radu skupine skupine američkih biologa iz 2007. godine na čelu s Patricom Brown sa Sveučilišta Stanford. Tijekom prve godine života pratili su formiranje mikrobiota u 14 novorođenčadi. Autori su uspjeli uspostaviti nekoliko izvora kolonizacije gastrointestinalnog trakta. Mikrobija beba slična je majčinoj mikroflori: vaginalni, fekalni ili mikroflori uzorci majčinog mlijeka. Ovisno o izvorima kolonizacije, u mikroflori crijeva dojenčadi tijekom prve godine života, dominirale su različite vrste. Te su razlike ostale značajne tijekom cijelog razdoblja proučavanja, ali su u dobi od jedne godine postale očite značajke formiranja odraslog mikrobiota. Zanimljivi podaci dobiveni su upotrebom para blizanaca. Njihova mikroflora bila je praktički identična u sastavu i varira na isti način. Ovo otkriće otkrilo je ogromnu ulogu ljudske komponente para mikrobiota domaćina u formiranju populacije crijevne mikroflore. Za čistoću eksperimenta, naravno, trebali bismo razdvojiti bebe natrag u bolnicu - veliku priču za indijski film! Godinama kasnije, one se međusobno upoznaju analizom... Ali druge su studije potvrdile pretpostavku da pojedinačne, uključujući hereditarno uvjetovane, obilježja ljudske biokemije imaju veliki utjecaj na sastav mikrobiota.

Mikroba u nama više nego ljudsko

Osim proučavanja pojedinih vrsta crijevne mikroflore, u posljednjih nekoliko godina, mnogi znanstvenici su proučavanjem bakterija metagenom - set gena svih organizama u uzorku sadržaja ljudskom crijevu (ili ispiranje kože, ili u uzorku blata s morskog dna). U tu svrhu, najviše automatiziran, kompjuterizirana i tehnologije sekvenciranja DNA visokih performansi koji omogućuju analizu kratke nukleotidnih sljedova, prikupiti puzzle nekoliko poklapa „slova” na krajevima tih dijelova, multiple Ovaj postupak ponovite za svaki komad genoma i primati dekodiranje pojedinih gena i kromosoma po stopi do 14 milijuna nukleotida na sat - reda veličine brže nego što je učinjeno samo prije nekoliko godina. Tako je utvrđeno da je ljudski crijevni Microbiota ima oko 100 bakterijske stanice trillionov - oko 10 puta više od ukupnog broja master stanica u tijelu. Skup gena koji su dio bakterijske metagenome, oko 100 puta set gena u ljudskom tijelu. Ako govorimo o količini biokemijskih reakcija koje se javljaju u mikrobne populacije, to opet mnogo puta veća od one u ljudskom tijelu. Bakterijski „reaktor” primjenjuje u domaćina metabolizma lanca koji to nije u stanju da se podržati - na primjer, sinteza vitamina i njihovih prekursora, razgradnja nekih toksina, razgradnja celuloze u neprobavljivih polisaharida (u preživača) itd

Istraživanja provedena u laboratoriju Jeffrey Gordon (School of Medicine na Sveučilištu Washington, St. Louis, MO) će se vezati raznolikost vrsta bakterija iz probavnog trakta s prehranom i karakteristikama pojedinog metabolizam. Rezultati eksperimenta objavljeni su u prosincu u Prirodnoj godini u prosincu 2006. godine. Godišnji eksperiment sugerira uspostavljanje korelacije između prekomjernog tjelesne mase u osobi i sastava mikrobne populacije njegovog crijeva. Desetak muškaraca koji su pristali staviti trbuhe na oltar znanosti bili su podijeljeni u dvije skupine. Jedno selo na prehrani niske masnoće, drugo - s niskim sadržajem ugljikohidrata. Sve volontera izgubili na težini, a istovremeno su promijenili odnos dviju glavnih grupa crijevnih mikroorganizama: broj stanica firmicutes smanjio, dok je broj Bacteroidetes, naprotiv, povećava. Na niske masnoće dijeta, kao promjena, postao poznat kasnije - nakon što su pacijenti izgubili 6% po masi, a malo ugljikohidrata - nakon što je izgubio prvi kilograma (2% od početne tjelesne težine). Promjena u sastavu mikroflore je više izražen je manja težina postala sudionici u eksperimentu.

Istovremeno u istom laboratorijskih eksperimenata provedena na laboratorijskim miševima koji nose mutaciju u genu za leptin „- sitost hormona” protein koji je sintetiziran u masnim stanicama tkiva i stavlja svoj doprinos za formiranje sitosti. Miševi u kojoj su obje kopije oštećenih gena (ta mutacija označen je indeks Lep ob), jedu 70% više u odnosu na divlji tip, sa svim nadolazećim posljedicama u. A sadržaj firmicutes u crijevima i pol puta veća od one od heterozigotnih linije, sa samo jednim defektnom alela (ob / +) i homozigotni za gen normalno soja divljeg tipa (+ / +).

Utjecaj mikroflore na metabolizam svog "domaćina" istraživača testiran na drugom modelu - gnotobiotičkim miševima.

Takve životinje, od rođenja žive u sterilnim komorama, a nikad u životu sreo jednu mikrob koji se koristi u biomedicinskim istraživanjima nije često. Apsolutna sterilnost myshatnike, rabbitry a osobito koza štali - skup i teško, a nakon sastanka s prvim mikroba ili virus ili loše umrijeti ili postati neprikladan za daljnje pokuse. Što se događa u gnotobiote s imunološki sustav - je druga priča, i jedu za tri, au isto vrijeme - kože i kostiju zbog nedostatka mikrobne razgradnje komponente.

Nakon transplantacije mikroflora iz pretilih (ob / ob) donora, gnotobiotični miševi su gotovo 50% masirani za dva tjedna (za 47%). Oni koji su "posijani" s mikroflora od divljih (+ / +) donatora s normalnom težinom, oporavili su se samo za 27%.

Rezultati daljnjih studija o promjenama u simbiotskom mikroorganizmu miša i mikroba briljantno su potvrdili hipotezu da mikrobiota pretilih osoba doprinosi dubljoj preradi hrane. Usporedba uzoraka DNA stolice pretilih i normalnih miševa pokazala je da su miševi preminulih miševa zasićeni enzimskim genima koji omogućuju učinkovitije razgradnje polisaharida. Crijeva pretilih miševa sadržavale su velike količine konačnih fermentacijskih produkata - spojeva octene i masne kiseline, što ukazuje na dublju obradu sastojaka hrane. Kalorimetrijska analiza (iz riječi "kalorije"!) Analiza uzoraka stolica je potvrdila ovo: stolica ob / ob miševa sadržavala je manje kalorija od miševa divljeg tipa koji nisu u potpunosti apsorbirali energiju iz hrane.

Osim važne informacije o „klica” komponente pretilosti, autori su mogli pokazati temeljnu sličnost između mikroflore pretilih ljudi i miševa, što otvara nove perspektive u proučavanju problema prekomjerne tjelesne težine, a možda - i da se riješi ovaj problem „transfer” zdrave mikroflore ili njenog formiranja u bolesnika, koji pate od pretilosti.

Činjenica da mikrobiota može kontrolirati metabolizam domaćina više nije u nedoumici. Studije Gordon laboratorijske posvećenih problemu prekomjerne težine je moguće premostiti jaz u liječenju metaboličkih bolesti, kao što je kaheksija, utječe na djecu od jedne do četiri godine u siromašnim tropskim zemljama - marazmus (na idiotizam ta riječ ima samo lingvistički: Grčki marasmos. doslovno znači osiromašenje, izumiranja) i kvašiorkor (u jeziku jednog od plemena Gani kvašiorkor - „crveni dječak”). Pojava bolesti povezanih s nedostatkom vitamina proteina i na prijelazu iz dojenja na odrasle hrane. Ali bolest selektivno pogađa djecu čiji su braća i sestre nisu imali problema s prijelazom na tradicionalne prehrane ove regije. Istraživanja su pokazala da je crijevna mikroflora bolesne djece je vrlo različita od mikroflore njihovih roditelja, kao i mikroflore zdravih braće i sestara. Prije svega istaknuo gotovo potpunu odsutnost crijevne populacije Bacteroidetes i dominacije rijetkih vrsta koje pripadaju vrstama Proteobacteria i Fusobacteria. Nakon bolesne djece (pazite da ne predozirati!) Tove teško proteina hrane, njihova Microbiota postaje slična normalno, kao što su rodbina, uz prevlast Bacteroidetes i firmicutes.

Studije posljednjih godina ne samo da su radikalno mijenjale prevladavajuće ideje o crijevnoj mikroflori čovjeka, već su pridonijele i pojavi koncepta koji smatra crijevnu mikrobiotu kao dodatni višestanični "organ" ljudskog tijela. Orgulje koje se sastoji od različitih staničnih linija, sposobnih međusobno komunicirati, kao i s organizmom domaćina. Orgulje koji redistribuira tokove energije, obavlja važne fiziološke reakcije, mijenja pod utjecajem okoliša, te samopromijenjuje promjene uzrokovane vanjskim uvjetima.

Nastavak istraživanja „bakterijska tijelo” može i mora dovesti do razumijevanja zakona njenog rada, objavljivanje svojih delikatnih odnosa s domaćinom, a kao posljedica toga, pojavom novih metoda borbe protiv ljudskih bolesti koje ciljano liječenje poremećaja oba metaorganizma komponente.

Valery Poroiko, dr.sc.
Sveučilište u Chicagu, Odjel za opću kirurgiju
Portal «Vječna mladost» www.vechnayamolodost.ru

Časopis verzije članka objavljen je u "Popular Mechanics" br. 4-2008

Specifična identifikacija bakterija metodom sekvenciranja 16S gena ribosomske RNA, uloge i mjesta metode u dijagnostici bakterijskih infekcija Završeno: Savelyeva. - prezentacija

Prezentacija je objavljena prije 4 godine od strane Ljidhina Šambojina

Srodne prezentacije

Predstavljanje 11. razreda na temu: "Specifična identifikacija bakterija metodom sekvencioniranja 16S gena ribosomske RNA, uloga i mjesto metode u dijagnozi bakterijskih infekcija Završeno: Savelyeva". Preuzmite besplatno i bez registracije. - Prijevod:

1 Vrsta identifikaciju bakterija koje sekvenciranja gena 16S ribozomalnog RNA, ulozi i mjestu metode u dijagnostici bakterijskih infekcija ispunjen: Savelieva Xenia ispunjen: Savelieva Xenia, učenik 11 specijalizirana klasa učenik 11 specijalizirana klasa MBOU Krasnoobsk SOSH 1 MBOU Krasnoobsk SOSH 1 Nadzornik: supervizor : Cand. biol. Znanosti Afonyushkin Vasily Nikolaevich Cand. biol. Znanosti Afonyushkin Vasily Nikolaevich

2 Ciljevi: 1. svladati DNA elektroforeze na agaroznom gelu 2. Da bi saznali metodu za analizu rezultata sekvenciranja i provode izgradnju nukleotidnih sljedova, fragmenti gena 16 S ribosomalnom RNA izolata dobivenog svladati roda Bacillus 1. DNA elektroforeze na agaroznom gelu 2. Da bi saznali metodu za analizu rezultata sekvenciranja i provesti izgradnju nukleotidnih sljedova, fragmenti gena 16 s ribosomske RNA izolata dobivenog roda Bacillus 3. ispitati perspektive dijeljenje sekvenciranja tehnike i biokemije Identifikacija cal bakterija 3. proučavati izglede za dijeljenje metoda sekvenciranja i biokemijski identifikacija bakterija Cilj: istraživanje mogućnosti primjene metode specifične identifikacije bakterije koje sekvencioniranje 16S ribozomalnog RNA u kombinaciji s tradicionalnim metodama identifikacije

3 Materijali i metode čiste kulture izolata su stavljene na MPA sati, nakon inkubacije bakterijska suspenzija se pripravlja u fosfatno puferiranoj otopini soli. Kulture su obojene Gram-om i mikroskopom. Procijenjena nakon biokemijskih svojstava: Odlaganje citrat, malonat, glukozu, laktozu, manitol, saharozu, inozitol, sorbitol, arabinozu, maltozu, fenilalanin, Dobivanje indola, sumporovodika, atsetilmetilkarabinola (Reaction Foges- Proskauer), prisutnost beta-galaktozidaze, ureaza, arginin dekarboksilaze i lizin, hidrolaze arginina. Kulture su testirane na katalaze, oksidaze citokroma, formiranje nitrita, sinteza pigmenta, otpornosti na antibiotike, te proučavao kulturu i morfološka svojstva. Beta-galaktozidaze, i tritofandezaminaznuyu glyukoronidaznuyu aktivnost testirana u mediju Uriselekt 4 (BioRad) DNA je izoliran pogled fenolhloroformennym utvrđuje na temelju sekvencioniranje 16S ribosomna gena RNKi fragmenta međugenskog odstojnika ribosomske RNA i 16-23S više biokemijskih, kulturnih i morfološke karakteristike.

4 Kulturna svojstva: uzgojene kulture nisu rasti na Endo okolini; ne odnose na enterobakterija, uzgaja na meso-peptona agar pod aerobnim uvjetima na 37 ° C bojom: kultura izrasla mikroskopski i Gram-bojenje koji ostavljena da se utvrdi da je dobivena kultura spore Gy + štapići karakteristike Cultures

Shema istraživanja: DNA je uzgojena iz uzgojene kulture i primijenjena je PCR s univerzalnim klicama, kao rezultat, amplificirali smo fragment 16S gena ribosomske RNA

6 s otopinom početnice raspoređeni u 4 epruveta, od kojih je svaki od četiri deoxynucleotide dATP, dCTP, dTTP (jedan radioktivnym izotop obilježeni) i jedan od četiri 2, 3- (dideoxynucleotides ddATR, ddTTR, ddGTP, dd MFR) dideoksinukleotidnim uključen je u svim pozicijama rastuće lanaca smjesu, a nakon ulaska u rast lanca je odmah prekinuti. Kao rezultat toga, na svakom od četiri cijevi uz sudjelovanje DNA polimeraze generira jedinstveni skup olignukleotidov sadrže različite duljine praymerovuyu slijed. Nadalje, cijevi doda se formalid divergencije lanaca i elektroforezi na gelu poliakrilne cheteryh zapisa. Provedite radiografiju, što ga čini moguće „čitati” sekvencioniranje nukleinske sekvence DNK segmenta. U biokemiji i molekularnoj biologiji elektroforezom se koristi za odvajanje makromolekularne proteine ​​i nukleinske kiseline (i njihove fragmente). Postoji mnogo vrsta ove metode. Ovaj postupak Nalazi široku primjenu za odvajanje smjese biomolekula u frakcije ili pojedine tvari i koristi se u području biokemije, molekularne biologije, kliničkoj dijagnostici, biologije populacija (za proučavanje genetskih varijacija) i dr.belkovnukleinovyh kiselinama elektroforezi to elektrokinetički fenomen pomak disperzne faze (koloid ili protein otopina) u tekućem ili plinovitom mediju djelovanjem vanjskog električnog polya.elektrokineticheskoe yavlenieelektricheskogo polyaElektroforez Shema istraživanja: PCR proizvodi su razdvojeni metodom agaroza gel elektroforeze. Sangerova metoda

7 Rezultati vlastitog istraživanja Slika 1. Rezultati kapilarne elektroforeze fragmenta 16S gena ribosomske RNA

8 Sl. 2 filogenetsko stablo konstruirano na osnovi rezultata poravnanja fragmenta 16S gena ribosomske RNA

9 Rezultati vlastitog istraživanja Sl. 3 Rezultati usporedbe nukleotidnih sekvenci

10 Rezultati biokemijske studije kultura pomoću testa PBDE biokemijska svojstva soja B.licheniformis: negativan iskorištenja citrat, malonat negativne, natrijev citrat + glukoza negativno negativno negativno lizin, arginin, ornitin, negativno negativno fenilalanin, indol negativne, ureaza pozitivne atsetilmetilkarabinol negativno sulfid negativan, pozitivan, glukoza, b-galaktozidaza pozitivni, negativni laktozu, manitol pozitivne, pozitivan saharozu, inozitol pozitivno o, sorbitol je pozitivan, maltoza je pozitivna

Zaključak Identifikacija vrsta mikroorganizama na osnovi sekvenciranja može biti "zlatni standard" laboratorijske dijagnostike, ali točnost metode ograničena je pouzdanost i cjelovitost baza podataka GenBank te stoga zahtijeva dodatnu upotrebu potvrđenih testova.

Analiza 16S RNA

Biotechnology, 2005, № 6, od 3-11

Predložena je metoda za identifikaciju mikroorganizama na temelju analize polimorfizma duljine restrikcijskog fragmenta (PCRF) 16S RNA genskog produkta duljine 1500 nukleotida. 6 odgovaraju set restrikcijskim endonukleazama (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI i RsaI) pomoću RFLP omogućuje identifikaciju širokog spektra mikroorganizama.
Četiri izolata termolabilne alkalne fosfataze izolirane su iz prirodnih izolata morske vode. Analiza PFR za ove sojeve u usporedbi s izračunatim rezultatima dobivenim za 16S RNA geni raznih mikroorganizama omogućila je utvrditi da su identificirani proizvođači pripadali rodu Alteromonas.

Zajedno s tradicionalnim metodama identifikaciju mikroorganizama primjenom kulturnih i morfološke karakteristike, kao i kemijske i biokemijske reakcije [1], u posljednje vrijeme sve više i više naširoko koristi metoda za određivanje mikroorganizama na temelju usporedbe nukleotidnih sekvenci gena različitih mikroorganizama [2-4] i polimorfizam duljine analiza DNA restrikcijskih fragmenata dobivenih pojačanje specifičnih bakterijskih gena [5,6]. Najbolji su pogodni za identificiranje gena koji kodiraju 16S i 23S RNA ribosoma, budući da su prisutni u svim bakterijskim stanicama su specifičnom za rod i za većinu mikroorganizama [7-9]. Upotrijebiti za identifikaciju DNA fragment koji sadrži oba gena 16S i 23S RNA, i odstojnik se nalazi između njih, a još su varijable, omogućuje da se razlikovati blisko srodne vrste i podvrste mikroorganizama [10].

U radu su prikazani rezultati RFLP analize PCR proizvoda 1500 nukleotida u duljinu za različite mikroorganizme i pokazala da korištenje ograničenja endonukleazama 6 Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI RsaI i mogu pouzdano identificirati većinu mikroorganizama. U radu se identificirali 4 producenta nepostojan na toplinu alkalne fosfataze i predložene metode, komparativnom analizom RFLP za identifikaciju tih mikroorganizama. Na temelju usporedbe zaključuje da proizvođači rezultata pripada rodu Alteromonas.

EKSPERIMENTALNI UVJETI

Detektirati proizvodnju termolabilna alkalna fosfataza 50 l morske vode se usitni na hranjivom agaru površini i analizirani kako je opisano u [11]. Priprava mikrobne biomase su provedena po rastu za proizvodnju na 20 ° C u juhu koji sadrži 1% triptona (AGS GmbH, Njemačka), 0,5% ekstrakta kvasca (ista tvrtka) i morske soli voda (NaCl - 27,5, MgCl₂ - 5, MgS04₄ - 2, CaCl₂ - 0,5, KCl - 1, FeS04 - 0,001 g / l [12]), pH 7,2 - 7,7. Sjemenki bujon je bio raspodijeljen u volumetrijskim tikvicama od 200 ml do 700 ml i tresao se pri 150 okretaja u minuti tijekom 16 sati.

Izolacija kromosomske DNA provedena je metodom [13].

Povećanje 16S gena ribosomske RNA provedeno je reakcijom lanca polimeraze kako je opisano u [14].

Restrikcijska reakcija amplificirane DNA provodi se 4 sata na 37 ° C u 20 ul reakcijske smjese koja sadrži 2 ekv. čin. restrikcijski enzimi Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI ili RsaI iz SibEnzyme NGO, u odgovarajućem puferu. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 5 ul otopine za zaustavljanje koja sadrži 0,1 M EDTA, 0,05% bromfenol plave i 40% saharozu.

Elektroforetski odvajanje restrikcijskih proizvoda iz amplificirane DNA provedeno je u 2% agarozi (Sigma) u Tris-acetatnog pufera s etidij bromidom (0,5 mg / L) na 120 V tijekom 4 sata.

DNA markere molekulske težine (100 bp +1,5 kb DNA markeri, NGO "SibEnzim") korišteni su za određivanje duljine DNA fragmenata. Duljina dobivenog ograničenja određena je računalnim programom Gel Pro Analyzer, verzija 4.0.00.001. Postotak identiteta duljine fragmenta izračunat je za svaki par mikroorganizama uspoređujući uzorke ograničenja odvojeno za svaki restrikcijski enzim. Kad se uspoređuju duljina ograničenja, DNA fragmenti identično duljine procijenjeni su da se razlikuju za najviše 5%.

Da bi se usporedili eksperimentalni podaci s objavljenim sekvencama 16S RNA gena, korištena je genetska baza podataka sekvenciranih sekvenci.

REZULTATI I RASPRAVA

Od prirodnih izolata morske vode izolirali smo četiri sojeva termolabilne proizvodnje fosfataze označene kao 20, 27, 48 i soja ranije karakterizirana [11] koristeći tradicionalne metode kao Alteromonas undina. Da bi se identificirali sojevi dobiveni iz biomase mikroorganizama uzgojenih u tekućem hranjivom mediju uz dodatak morskih soli, izolirana je kromosomska DNA.
Sljedeći, kromosomsku DNA se koristi u lančanom reakcijom polimeraze za pojačavanje gena RNA je 16S ribosomalni. Produkt amplifikacije pomiješa samostalno 6 različitih restrikcijskih endonukleaza. Sve smo koristili tetranukleotidno restrikcijske endonukleaze mjesto prepoznavanja, što omogućuje da se dobije od 3 do 8 DNA fragmenata nastalih cijepanjem na pojačanja produkta, koji ima duljinu od oko 1500 bp. Ograničenje enzim i koriste Sse9I Tru9I su redom aatt prepoznavanje mjesta i TTAA dok BsuRI i MspI ograničenje enzima cut mjestima GGKK i CCGG. Prepoznavanje restrikcijskih enzima BstMBI i RsaI, odnosno GATC i GTAC, sadrži u svom sastavu sve četiri nukleotida. Takav odabir restrikcije endonukleaze je, po našem mišljenju, pružiti fleksibilnost u identifikaciji mikroorganizama koji imaju obje od ~ bogati ili GC- bogate genoma. U kvantitativnom smislu, korištenje samo šest različitih ograničenja vjerujemo optimalna, jer je upotreba ograničenja endonukleazama 1 ili 3, kao što je sugerirano u nekoliko studija [10,15] ne može otkriti polimorfizama za identifikaciju usko povezanih organizama ili, alternativno, dovode do prevelike razlike Iž za jednu ili više slučajnih mutacija. Međutim, upotreba 10 različitih ograničenja ne uzrokuju dodatni endonukleaze otkrivanje polimorfizma duljine restrikcijskih fragmenata DNA je jasno suvišan [9].
Slika 1 prikazuje simulirani pomoću ograničenje računalo slike genov16S RNA, mi smo predložili niz od šest restrikcijskih enzima (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI i RsaI). Geni 16S RNA se uzimaju u genetskoj banci sekvenciranih sekvenci. Izbor mikroorganizama bio je posve slučajan. Sve bakterije pripadaju različitim rodovima i predstavljaju gram-negativne i gram-pozitivne mikroorganizme. Može se vidjeti da za sve mikroorganizme postoji jedinstveni uzorak skup restrikcijskih enzima. Broj DNA fragmenata kreće se od 23 do 30 (dužina fragmenata manjih od 100 parova nukleotida nije uzeta u obzir). Rezultati izračuna postotak identiteta duljina DNA fragmenata (restrikcijskim fragmentom sinonim duljine razlikovati za više od 5%), za različite parove mikroorganizama prikazanim u tablici 1. To tablica prikazuje samo dio moguća para mikroorganizama je prikazano na slici. 1. Međutim, prikazani rezultati usporedbe su vrlo tipični i omogućuju da se vidi da je postotak identiteta duljine DNA fragmenata obično u rasponu od 12 do 28% za predstavnike različitih mikrobnih rodova. Prema tome, prikazani podaci pokazuju da su uzorci ograničenja 16S RNA gena na skupu restrikcijskih enzima predloženi od strane nas mogu poslužiti kao osnova za identifikaciju generičkog pribora bakterijskih stanica.

Sl. 1. Teorijski izračunate uzorak elektroforetskog razdvajanja 16S RNA amplifikacije gena proizvoda nakon obrade s restrikcijskim enzimima Sse9I (1), Tru9I (2), BsuRI (3), MspI (4), BstMBI (5) i RsaI (6). Staze M - marker molekularne težine

Vrijednost 16S RNA u taksonomiji. Molekularna hibridizacija 16S RNA.

Molekularna hibridizacija 16S rRNA. Prokariotski ribosom se sastoji od 3 podjedinice, velike (23S), (5S) i (16S). Gene 16S rRNA ima sljedeća svojstva, važna u filogenezi:

1. RNA Ribosomi su univerzalni za različite vrste, poput samih ribosoma. 2. Molekula 16S rRNA je konzervativna i najmanje podložna promjenama u tijeku biološke evolucije. Stopa promjene 16S rRNA gena u različitim simbiotskim bakterijama bila je 2-4% nukleotidnih supstitucija unutar 60 mi.3. Gene 16S rRNA ima i ultrakonservativne i varijabilne domene (domene), što omogućuje procjenu udaljenih i bliskih odnosa.4. Pored toga Nadalje, utvrđeno je da rRNA cystroni nisu uključeni u procese genetskog prijenosa među vrstama.5. Veličina gena (u prokariotima je približno 1550-1640 bp) optimalna s gledišta smanjenja statističkih pogrešaka. Cijeli slijed može se odrediti u jednom sekvenciranju Sangerovom metodom.Usporedba nukleotidnih kataloga. Metoda je korištena u ranim 80-ima i imala je velik povijesni značaj u sistematizaciji bakterija. U ovom slučaju, RNA molekula (16S rRNA) tretirana je s ribonukleazom T, koja cijepa molekulu preko ostataka guanina. Veličina dobivenih fragmenata nije bila veća od 20 nukleotida. Dobiveni oligonukleotidi su razdvojeni 2-mer elektroforezom, sekvencionirani i napravili katalog koji specifično karakterizira rRNA molekulu. Prilikom uspoređivanja kataloga uzeti su u obzir fragmenti od najmanje 6 nukleotida. Primjenom koeficijenata sličnosti između kataloga najprije je napravljen opći filogenetski stablo za prokariote. Riboprinting. Metoda se temelji na restrikcijskoj analizi rRNA gena. Da biste to učinili, izolirati ukupnu DNA iz ćelije. Uzeta su dva prajmera homologna za visoko očuvana bočna područja 16S rRNA (male podjedinice-ss rDNA) gena i izvedena je PCR. Fragmenti se tretiraju s nekoliko restrikcijskih endonukleaza, a restrikcijski produkti za svaku od endonukleaza se odvoje u agaroznom gelu zajedno s profilom veličine DNA. Polimorfizam duljine fragmenta nastaje zbog činjenice da neke od restrikcijskih mjesta spadaju u konzervativne domene gena, a neke - u varijabilne domene. U isto vrijeme, neki fragmenti će biti zajednički za sve vrste u uzorku. Prema broju zajedničkih i različitih fragmenata, moguće je izračunati genetsku udaljenost između vrsta. Korištenje 12 restrikcijskih enzima s mjestima prepoznavanja 4 nukleotida dugačak omogućuje pokrivanje 10-15% duljine gena 16S rRNA analizom, bez potrebe sekvencioniranja.

Dragi mikrobi

Valery Poroiko,
Ph.D., Sveučilište u Chicagu, Odjel za opću kirurgiju
Popularna mehanika №4, 2008

Prije samo stotinu godina, mikroorganizmi koji su živjeli u ljudskom crijevu bili su smatrani freeloaderima i štetnicima. Posljednjih godina, ljudska mikrobiota je nazvana vrsta organa našeg tijela, neophodna za normalni život tijela.

Od dana Pasteura, poznato je da je ljudski gastrointestinalni trakt u osnovi bioreaktor protoka u kojemu nastanjuju mnogi mikroorganizmi. Stav znanstvenika prema crijevnoj mikroflori tijekom tog razdoblja radikalno se promijenio. Prije sto godina, veliki Ilya Mechnikov, osnivač moderne teorije o imunitetu, za stvaranje što je dobio Nobelovu nagradu (za dvije osobe s njegovom neumoljivom protivnika, ne manje nego veliki Paul Ehrlich), čak predložio uklanjanje debelog crijeva kao način za produljenje života. A oni kojima je ta mjera činilo previše radikalan, preporuča se piti puno jogurta da bi se uklonio štetni, po njegovom mišljenju, mikroba blagotvoran laktobacili. Za pola stoljeća tečaj se promijenio za 180 stupnjeva. Pokazalo se da normalna mikroflora crijeva, kao i koža i sluznice, obavlja mnoge korisne funkcije - na primjer, potiskuje vitalnu aktivnost patogenih mikroorganizama koji napadaju tijelo. I u posljednjih nekoliko godina, najsmjeliji mikrobiologa su otišli dalje izjavljujući osobu i njene simbiotskih mikroba jedan superorganizam.

Razvoj metoda molekularne biologije vodio je znanstvenike na novu razinu razumijevanja procesa simbioze čovjeka i njegove mikroflore, koja se činilo dobro proučavana, a iz daljnjeg proučavanja kojih nisu očekivali posebna iznenađenja. Brz rast redukcije brzine i troškova sekvencioniranja DNA (određivanje njene nukleotidne sekvence) i paralelnog rasta osobne računalne snage i razvoja interneta omogućilo je analizu podataka o velikim dijelovima genoma. Nakon što su kromosomi od stotina vrsta pojedinačnih bakterija bili dešifrirani, u genetici mikroorganizama nastao je novi pristup: pristup stanovništvu: analiza gena svih bakterija nastanjenih u određenom području. Naravno, populacija "humanog bioreaktora" pokazala se kao jedna od najvažnijih za proučavanje mikrobnih populacija.

Prvi rad, koji je napravio sasvim novi izgled crijevne mikrobiote, 1999. godine objavila je skupina znanstvenika iz Nacionalnog instituta za agronomske znanosti (Francuska) i Sveučilišta u Readingu (UK). Autori su odlučili koristiti metodu sekvencioniranja 16S RNA gena za proučavanje mikrobne intestinalne populacije (vidi bočnu traku).

16S PHK - identifikacija bakterija

Prva faza određivanja mikroorganizama jest njihov uzgoj na hranjivim medijima. Ali broj mikroba ne želi rasti na bilo kojem od medija

Suvremene tehnike
Studija je prethodno nedostupna nisu kulturabilnih bakterija i početi da uvede red u posve zbunjujućim taksonomija već poznate prokariotske postalo je moguće s razvojem bioinformatike i pojavom modernih tehnika molekularne biologije - PCR omogućuje DNK regija primati milijarde replike, kloniranje odabranog gena u bakterijskih plazmida i sekvenciranje sekvence metodologije nukleotide dobivene u dovoljnoj količini za analizu. Idealno marker za identifikaciju mikroorganizama pokazali gena koji kodiraju 16S ribosomna RNA (svaki od dva ribosomskih podjedinica - radionice sintezu staničnog proteina - sastoji se od usađenih lanaca molekula proteina i ribonukleinskih kiselina).

Savršeni marker
Ovaj gen je u genomu svih poznatih bakterija i arheje, ali nema u eukariota i virusa, a ako ste pronašli svoj karakterističan slijed nukleotida - Jeste li sigurni da se bave genima prokariota. Ovaj gen ima i konzervativna mjesta, jednaka za sve prokariote, i specifične za vrstu. Konzervativne parcele su prvi stadij lančane reakcije polimeraze - dodatak na ciljne DNA klica (sjemena DNA dijelovi na kojima proučavali Nukleotidni lanac treba pridružiti za početak analize ostatak sekvence) i za vrste specifičnih - za identifikaciju vrsta. Stupanj sličnosti vrsta specifičnih mjesta odražava evolucijski odnos različitih vrsta. Za kloniranje i naknadnu analizu može se upotrijebiti ribosomna RNA koja je u bilo kojoj stanici prisutna u većoj količini od odgovarajućeg gena. Općenito su dostupne nukleotidne sekvence 16S RNA svih poznatih bakterija i arhea. Identificirane sekvence uspoređuju se s onima koji se nalaze u bazama podataka i identificiraju vrste bakterija ili izjavljuju da pripadaju nekulturziranoj vrsti.

Nova sustavnost
Nedavno je provedena intenzivna revizija stare, fenotipske klasifikacije bakterija na temelju slabo formaliziranih kriterija - od pojavljivanja kolonija do preferencija hrane i sposobnosti da se boji različitim bojama. Nova sustavnost temelji se na molekularnim kriterijima (16S RNA) i samo djelomično ponavlja fenotipski.

Što imamo unutra

Kodirajuće sekvence 16S RNA pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR) povučen izravno iz „okoline” - 125 mg čovjeka, Nažalost, stolica je umetnut u plazmid E. coli (nije zato što intestinalni, te zbog Escherichia coli - jedan od omiljenih radnih konja molekularnih biologa) i opet izoliran iz kulture umnoženih bakterija. Tako je stvorena biblioteka 16S RNA gena za sve mikroorganizme u uzorku. Nakon toga, 284 klonova su slučajno odabrani i sekvencionirani. Ispalo je da samo 24% dobivenih 16S RNA sekvenci pripada prethodno poznatim mikroorganizmima. Tri četvrtine mikroflore nalazi u crijevima svakog čovjeka, više od stotinu godina izbjegavali pozornost istraživača, naoružani metodama klasične mikrobiologije! Znanstvenici jednostavno ne mogu naći uvjete za uzgoj tih bakterija, jer je većina ćudljiv stanovnici crijeva odbio ustati na tradicionalne mikrobnih okruženja.

Do danas, korištenjem molekularnih metoda, utvrđeno je da 10 od 70 velikih bakterijskih taksona je prisutno u odraslih mikrobiota. Oko 90% naših mikroorganizama pripada tipu firmicutes (to uključuje, na primjer, poznati laktobacila - glavni „krivci” souring mlijeko) i Bacteroidetes - obvezuje anaerobi (organizama koji mogu živjeti samo u nedostatku kisika), koje se često koriste kao pokazatelj onečišćenja prirodnu kanalizaciju vode. Preostalih 10% populacije podijeljena između svojti Proteobacteria (to su, između ostalih, E. coli), aktinobakterije (iz jedne od vrsta Actinomycetes antibiotika streptomicina se izolira), Fusobacteria (normalne stanovnika u usnoj šupljini, a često uzrokuju parodontitis), Verrucomicrobia (nedavno je u geotermalnog izvora otkriveno je oblik mikroba koji se hrane metanom, koji obiluju u crijevima zbog drugih mikroorganizama), Cyanobacteria (oni su još uvijek često nazivaju stari - „plavo-zelene alge»), Spirochaetes (na sreću nd, ne blijeda), Synergistes i VadinBE97 (kakva životinja, pitajte kreatori novog taksonomiji prokariota).

Mikroba u nama više nego ljudsko

U tu svrhu, najviše automatiziran, kompjuterizirana i visoke performanse sekvenciranje DNA tehnologije, dajući priliku za analizu kratku sekvencu nukleotida, sastaviti slagalicu od nekoliko preklapanja „slova” na krajevima tih stranica više puta ponoviti ovaj postupak za svaki komad genoma i primati transkripte pojedinih gena i kromosoma s brzine do 14 milijuna nukleotida na sat - po redova veličine brže nego što smo mi prije samo nekoliko godina. Dakle, utvrđeno je da je crijevna Microbiota ima oko 100 trilijuna bakterijskih stanica - oko deset puta više od ukupnog broja ljudskih stanica u tijelu.

Skup gena koji čine bakterijski metagenom je stotinu puta veći od skupina gena ljudskog tijela. Ako govorimo o količini biokemijskih reakcija koje se pojavljuju unutar mikrobne populacije, opet opetovano prelazi volumen biokemijskih reakcija u ljudskom tijelu.

Bakterija „reaktor” provodi u domaćina metabolizma lanca koji je da nije u stanju da se podržati - na primjer, sinteza vitamina i njihovih prekursora, razgradnja nekih toksina, razgradnja celuloze za neprobavljivih polisaharida (u preživača), itd...

Od djetinjstva do starosti

Unatoč tome što je vrsta sastava crijevnih mikroorganizama prilično jednolična, kvantitativni omjer predstavnika određenih sustavnih skupina u mikrobioti različitih ljudi može se značajno razlikovati. Ali što je normalna crijevna mikroflora i koji su načini njezine formiranja?

Ovo je pitanje odgovoreno u radu skupine skupine američkih biologa iz 2007. godine na čelu s Patricom Brown sa Sveučilišta Stanford. Tijekom prve godine života pratili su formiranje mikrobiota u 14 novorođenčadi. Autori su uspjeli uspostaviti nekoliko izvora kolonizacije gastrointestinalnog trakta. Mikrobija beba slična je majčinoj mikroflori: vaginalni, fekalni ili mikroflori uzorci majčinog mlijeka. Ovisno o izvorima kolonizacije, u mikroflori crijeva dojenčadi tijekom prve godine života, dominirale su različite vrste. Te su razlike ostale značajne tijekom cijelog razdoblja proučavanja, ali su u dobi od jedne godine postale očite značajke formiranja odraslog mikrobiota. Zanimljivi podaci dobiveni su upotrebom para blizanaca. Njihova mikroflora bila je praktički identična u sastavu i varira na isti način. Ovaj nalaz je otkrio veliku ulogu ljudske komponente par „mikrobiota-domaćin” u formiranju populacije crijevne mikroflore. Za čistoću eksperimenta, naravno, treba imati odvojene bebe i dalje u bolnici (usput, prekrasan priča za indijskog filma! Godinama kasnije, blizanci upoznaju jedni druge na analizi mikroflore.). No, druge studije podaci potvrdili pretpostavku da pojedinac, uključujući i nasljedne, ljudske osobine biokemija imati velik utjecaj na sastav njegovog mikrobiota.

Tanak i debeli

Istraživanja provedena u laboratoriju Jeffrey Gordon (School of Medicine na Sveučilištu Washington, St. Louis, MO), povezati će raznolikost bakterija probavnog trakta s prehranom i karakteristikama pojedinog metabolizam. Rezultati eksperimenta objavljeni su u prosincu u časopisu priroda za 2006. godinu. Godišnji eksperiment sugerira uspostavljanje korelacije između prekomjernog tjelesne mase u osobi i sastava mikrobne populacije njegovog crijeva. Desetak muškaraca koji su pristali staviti trbuhe na oltar znanosti bili su podijeljeni u dvije skupine. Jedno selo na prehrani niske masnoće, drugo - s niskim sadržajem ugljikohidrata. Svi dobrovoljci izgubili su težinu, a istodobno su promijenili odnos dviju glavnih skupina crijevnih mikroorganizama: broj stanica Firmicutes smanjio se, a broj baktereroida, naprotiv, povećao se. Na prehranu s malo masnoće ova je promjena postala vidljiva kasnije - nakon što su pacijenti izgubili 6% težine, a na low carb dijetu - nakon gubitka prvog kilograma (2% početne tjelesne težine). Promjena u sastavu mikroflore je više izražen je manja težina postala sudionici u eksperimentu.

Borba protiv pretilosti

Rezultati daljnje proučavanje znanstvenicima promijeniti miš-simbiozi mikrobna organizam (vidi. Okvir „testiran na miševima”) sjajno je potvrdio tezu da je Microbiota pretilih pojedinaca povećava duboke obrade hrane. Usporedba uzoraka DNA stolice pretilih i normalnih miševa pokazala je da su miševi preminulih miševa zasićeni enzimskim genima koji omogućuju učinkovitije razgradnje polisaharida. Crijeva pretilih miševa sadržavale su velike količine konačnih fermentacijskih produkata - spojeva octene i masne kiseline, što ukazuje na dublju obradu sastojaka hrane. Kalorimetrijska (iz riječi "kalorije"!) Analiza uzoraka mišje stolice potvrdila je to: stolice ob / ob miševa sadržavale su manje kalorija od miševa divljeg tipa koji nisu u potpunosti apsorbirali energiju iz hrane.

Osim važne informacije o „klica” komponente autora pretilosti bili u stanju pokazati temeljnu sličnost između mikroflore pretilih ljudi i miševa, što otvara nove perspektive u proučavanju problema prekomjerne tjelesne težine, a možda riješiti ovaj problem „transfer” zdrave mikroflore ili njenog formiranja u bolesnika pate od pretilosti.

Ispitano na miševima

I iscrpljenost

Činjenica da mikrobiota može kontrolirati metabolizam domaćina više nije u nedoumici. Istraživanje Gordonovog laboratorija, posvećeno problemu prekomjerne težine, omogućilo je premošćivanje na liječenje metaboličkih bolesti. Među njima su takvi uobičajeni oblici iscrpljivanja, koji utječu na djecu od jedne do četiri godine u siromašnim zemljama s tropskom klimom, poput marasmus (do marasmus ove riječi ima samo jezični odnos: grčki. marasmoz doslovno znači iscrpljenost, izumiranje) i kwashiorkor (na jeziku jednog od Gana plemena kvašiorkor - "crveni dječak"). Pojava bolesti povezanih s nedostatkom vitamina proteina i na prijelazu iz dojenja na odrasle hrane. Ali bolest selektivno utjecati na djecu čije su braća i sestre nisu imali problema s prijelazom na tradicionalne prehrane ove regije. Istraživanja su pokazala da je crijevna mikroflora bolesne djece je vrlo različita od mikroflore njihovih roditelja, kao i mikroflore zdravih braće i sestara. Prije svega istaknuo gotovo potpunu odsutnost crijevne populacije Bacteroidetes i dominacije rijetkih vrsta koje pripadaju vrstama Proteobacteria i Fusobacteria. Nakon bolesne djece (pazite da ne predozirati!) Tove teško proteina hrane, njihova Microbiota postaje slična normalno, kao što su rodbina, uz prevlast Bacteroidetes i firmicutes.

Nedavne studije ne samo radikalno promijenio prevladavajuće predodžbe ljudske crijevne mikroflore, ali i pridonijela nastanku koncepta, koji smatra da je crijevna mikrobne kao dodatni višestanični „tijelo” čovjeka. Orgulje koje se sastoji od različitih staničnih linija, sposobnih međusobno komunicirati, kao i s organizmom domaćina. Orgulje koji redistribuira tokove energije, obavlja važne fiziološke reakcije, mijenja pod utjecajem okoliša, te samopromijenjuje promjene uzrokovane vanjskim uvjetima. Nastavak istraživanja „bakterijska tijelo” može i mora dovesti do razumijevanja zakona njenog rada, objavljivanje svojih delikatnih odnosa s domaćinom, a kao posljedica toga, pojavom novih metoda borbe protiv ljudskih bolesti koje ciljano liječenje disfunkcija dviju komponenata metaorganizma.

Analiza 16S RNA

Ribosomske ribonukleinske kiseline (rRNA) - nekoliko RNA molekula koje čine osnovu ribosoma. Glavna funkcija rRNA je provedba procesa prevođenja - čitanja informacija iz mRNA prilagodbom tRNA molekula i kataliziranjem stvaranja peptidnih veza između vezanih amino kiselina tRNA.

sadržaj

Ribosomalne pododjeljke i nomenklaturu rRNA

Na elektronsko-mikroskopskim slikama netaknutih ribosoma vidljivo je da se sastoje od dvije pod-čestice različitih veličina.

Omjer masa podstavaka je

2: 1; masa, pak, izražen u nazivnim mjerene neposredno taloženje (poravnanja stopu Svedberg jedinicama, S) na ultratsentrifugovanii, te se taj parametar je osnova za nomenklaturu i rRNA ribosoma i ribosomalnih podjedinica: Tip oznake koriste

Na primjer, ribosomna prokariotska RNA s sedimentacijskim koeficijentom od 16 Svedberg jedinica je označena kao 16S rRNA.

Budući da koeficijenti sedimentacije ne ovise samo o molekularnoj težini već i o obliku čestica, sedimentacijski koeficijenti za disocijaciju nisu aditivni: na primjer, bakterijski ribosomi s molekulskom masom

3 * 10 6 Dalton ima sedimentacijski koeficijent od 70S, označen kao 70S i disocira u podjedinice 50S i 30S:

Ribosomalne pododjelnice sadrže jednu rRNA molekulu velike duljine, čija je masa

1/2 - 2/3 mase ribosomalne podpojcice, dakle, u slučaju bakterijskih ribosoma 70S, 50S podsektor sadrži 23S rRNA (duljina

3000 nukleotida) i podskupina 30S sadrži 16S rRNA (duljina

1500 nukleotida); Veliki ribosomskih podjedinica, osim „dugi” rRNA također sadrži jedan ili dva „kratki” rRNA (5S rRNA bakterijskih 50S ribosomskih podjedinica ili 5S i 5.8S rRNA bolshii eukariotskim ribosomskih podjedinica).

sinteza

Ribosomalna RNA čini veliki udio (do 80%) ukupne stanične RNA, takva količina rRNA zahtijeva intenzivnu transkripciju njegovih kodirajućih gena. Taj je intenzitet osiguran velikim brojem kopija gena koji kodiraju rRNA: u eukariotima postoji nekoliko stotina (

200 kvasca) do desetaka tisuća (za različite linije pamuka prijavljeno je 50 do 120 tisuća kopija) gena koji su organizirani u nizove tandem ponavljanja.

U ljudi, geni koji kodiraju rRNA su također organizirani u skupine dvosmjernih ponavljanja smještenih u središnjim krajevima kratkih krajeva 13, 14, 15, 21 i 22 kromosoma.

Oni su sintetizirani pomoću RNA polimeraze I kao duge molekule pre-ribosomske RNA, koja je izrezana u pojedinačne RNA, koje čine osnovu ribosoma. U bakterijama i arheama, početni transkript obično uključuje 16S, 23S i 5S rRNA, između kojih se nalaze pre-rRNA sekvence uklonjene tijekom obrade. Obično se jedan ili više tRNA gena nalaze između 16S i 23S rRNA gena; Dakle, u E. coli inicijalni transkript ove grupe gena ima slijedeći slijed:

(16S rRNA) - (1-2 tRNA) - (23S rRNA) - (5S rRNA) - (0-2 tRNA)

Takav je transkript podijeljen na fragmente pre-rRNA i tRNA pomoću ribonukleaze III.

U eukariota 18S, 5.8S i 25/28 rRNA ko-transkribiraju se RNA polimerazom I, dok je 5S rRNA gen transkribiran pomoću RNA polimeraze III.

U eukariotima, mjesta koncentracije gena koji kodiraju rRNA obično su dobro vidljiva u jezgri stanice, zbog akumulacije ribosomskih podjedinica oko njih, što se odmah dogodi samoupravljanjem. Ove akumulacije dobro su obojene citološkim bojama i poznate su kao nukleolus. Prema tome, prisutnost jezgrama nije specifična za sve faze staničnog ciklusa: podjelu stanica jezgre u profaze disocira zbog sinteze rRNA i resuspendirana krajem Telofaza formira kada se nastavak sinteze rRNA.

Usporedna analiza pro i eukariotske rRNA

Ribosomalne RNA (poput ribosoma) prokariota i eukariota razlikuju se od drugih, iako pokazuju značajnu sličnost regija sekvenci. 70S Prokariotski ribosom se sastoji od velike podjedinice 50S (izgrađena na osnovi dvije rRNA molekule - 5S i 23S) i male 30S podjedinice (bazirane na 16S rRNA). 80 eukariotske ribosoma sastoji od velikog 60 podjedinice (konstruirane na temelju tri molekule rRNA - 5S, 5,8S i 28S i 40S) male podjedinice (konstruirane na temelju 18S rRNA).

Upotreba podataka o slijedu

Informacije o rRNA određenog organizma koriste se u medicini i evolucijskoj biologiji.

• RRNA gen je jedan od najkonzervativnijih (najmanje promjenjivih) gena. Stoga sustavni položaj organizma i vrijeme divergencije s pripadajućim vrstama mogu se odrediti na temelju analize sličnosti i razlika u rRNA sekvencama.
• rRNA je cilj velikog broja antibiotika, od kojih su neki koriste u kliničkoj praksi, i za inhibiciju rasta bakterija (antibiotika, prokariotske ribosoma vezivanja), te za liječenje bolesti kod ljudi (antibiotici vežu na eukariotske ribosoma). U prvu skupinu spadaju kloramfenikol, eritromicin, kasugamicin, mikrokokksin, spektinomicin, streptomicin, tiostrepton. U drugi higromicin B, paromomicin.